利巴韦林和金刚烷胺属于抗病毒药物，在防治人类流感类疾病方面应用广泛，但滥用这两种药物也会造成一系列负面效果。部分养殖户将其非法用于畜禽疫病防治，药物通过食物链进入人体，长期累积后会产生神经毒性，并直接诱导人类流感病毒产生变异及耐药性增强，从而威胁人类健康。

 

       美国 FDA 和我国农业部都已明确禁止将这两种药物作为兽药使用。然而，非法使用这两种药物的现象还时有发生。安捷伦开发了一种同时分析利巴韦林和金刚烷胺的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱方案，配合监管部门打击药物滥用的情况。

 

       利巴韦林和金刚烷胺分析

 

       对样品进行前处理。称取样品 2 ± 0.01 g，置于 50 mL 离心管中，加入 40 μL 混合内标溶液（ D15-金刚烷胺：200 μg/L，13C5-利巴韦林：1000 μg/L），再加入 5 mL 0.5 mmol/L 乙酸铵溶液 (pH 4.8) 和 40 μL 0.25 U/μL 酸性磷酸酶溶液（购于 Sigma 公司），涡旋 30 秒，置于摇床上，37 °C 恒温避光酶解 2 小时。

 

       在酶解液中加入 4 mL 5% 三氯乙酸溶液，涡旋 30 秒，10000 r/min低温离心 10 分钟，移取上清液于另一离心管中，用 5% 氨水调 pH 至 8.5 ± 0.1，加水定容至 10 mL，再次离心，得到上层澄清提取液。

 

       取 5 mL 样品提取液经 Agilent Bond Elut PBA/PCX 复合固相萃取柱富集和净化后，使用配备 Agilent Poroshell 120 SB-Aq 色谱柱的 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6470 三重四极杆液质联用系统对目标物进行分析。

 

       净化保留原理

 

       方法中所采用的 Bond Elut PBA/PCX 固相萃取柱可同时有效地保留和净化样品中的利巴韦林和金刚烷胺。PBA 可以同时保留酶解后游离出的核苷酸和利巴韦林，而在酸性洗脱条件下，利巴韦林被洗脱下来，而核苷酸在被洗脱后重新以阳离子交换机理保留 PCX 填料层；金刚烷胺在开始时以反相机理被保留在 PBA 或者 PCX 填料上，在酸性条件下洗脱利巴韦林时则在 PCX 填料层转换为阳离子交换机理进行保留，从而能够使用甲醇淋洗去除更多非极性保留杂质。整个前处理方法不但保证了更加干净的净化效果，同时也大大缩短了样品前处理时间。

 

       检测时，配合 Poroshell 120 SB-Aq 色谱柱对目标化合物进行分析，Poroshell 120 SB-Aq 色谱柱采用薄壳型极性修饰反相固定相 SB-Aq，可以耐 100% 的纯水相，使色谱柱在低 pH 条件下使用时也有较长的寿命，同时可实现对目标物的快速分离分析。

 

       本方法适合于鸡肉和鸡蛋中利巴韦林和金刚烷胺残留的检测。方法中利巴韦林和金刚烷胺的定量限分别为 0.08 ng/g 和 0.03 ng/g，分别在 0.1–1000 ng/mL 和 0.02–50 ng/mL 范围内线性相关良好。利巴韦林和金刚烷胺分别在 1.5–15 ng/mL 和 0.3–3 ng/mL 加标浓度下，在不同基质中的平均回收率分别为 94.26%–108.50% 和 86.66%–111.90%，RSD 均小于等于 3.75 (n = 3)。